小鼠ERG记录指南

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 武汉大学眼科研究所  沈吟     重庆艾尔曦医疗设备  陈波   023-65643528   www.ylsp168.com


        在视觉科学研究中,ERG是评估活体网膜功能的几乎唯一手段。动物ERG记录仪器是有一定规模的眼科学研究机构的必备工具。

        我怎么才能做出跟“别人的文章”里一样漂亮,重复性好,可靠性高的ERG曲线? 本文抛砖引玉,重点描述那些导致成功记录的重要细节。

        本文所述的方法同样适用于大鼠。


电极准备


1


金环电极两支:

        纯金金丝,尽量细,绕成直径约2-3mm的环状,焊接在电极导线上。

用途:

        正电极,分别接触左右眼角膜顶端。


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双头针电极:

        最细的普通缝衣针(一般地摊或者农贸市场才有卖),焊在电极导线上;另一端是双头连接器,便于同时连接两个通道的负极输入。

用途

        用于两个通道的公用负电极。

备注:

        普通缝衣针的材料是不锈钢;也许对于您所使用的电生理设备而言,表面镀银的针灸针更合适,表面镀银也有助于降低电极表面的极化效应,但缺点是针灸针硬度不够,扎入小鼠皮肤略有困难。


3


耳夹电极:

        涂上导电膏后夹小鼠尾巴上,作地电极。

备注:

        也可以使用针电极,扎在尾巴上。

        说明:上述电极可以找厂家买。


检查环境


暗室

        最好找一间没有窗户的房间,如果有窗,则必须厚重的窗帘将光全部遮挡。

        在房间内拉窗帘,一分为二,一边放置电生理的计算机,另一边放置闪光刺激器、放大器及实验动物平台。


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        注意窗帘必须及顶,及地,确保一点光都不透。

        好处:计算机显示器的光不会影响动物的暗适应。


暗红光照明

5            6            

        部分电生理设备可通过闪光刺激器提供暗红光照明;

        如果您的电生理没有此功能,可安装一个可调节亮度的红光台灯。

 

关掉固视灯

        在人的ERG记录中,闪光球中心的固视灯有助于人类固视(眼球不转,避免EOG静息电位的引入),但动物不会固视。因此,调整一下程序设置,关掉固视灯,以免影响暗适应。


暗适应

        动物应整夜暗适应,环境应做到绝对没有光线,伸手不见五指。

        动物转运时,可使用密闭的纸箱, 最好在纸箱的外部再包一层布,确保没有光透过缝隙进入纸箱内部。

7


        称重,腹腔内注射; 宜深度麻醉,浅度麻醉下动物沉重的呼吸可能导致金环电极与角膜不断接触-断开-接触-断开,最终表现为严重的信号基线不稳(大幅波动)。

        如果麻醉机可以搬进来,进行呼吸麻醉更好,可降低动物死亡的风险。

 

动物固定及散瞳


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        麻醉完成后,在暗红光照明下将小鼠用胶带固定在动物试验平台的前方:需保证小鼠正正经危“趴”,即相对于闪光刺激器的刺激口,双眼高度一致,充分暴露。

        滴“美多丽”散瞳。

 

电极安装

        以下操作在暗红光照明下进行。

        耳夹电极涂上导电膏,多一点不要紧,夹尾巴,插入放大器“地”接口;顺便说一句,试验完毕帮小鼠把导电膏檫掉,免得它醒来后嘴贱,吃了。

        双头的针电极插入后颈皮下(大致在两耳中间),同时接两个通道的“负”接口;

        金环电极夹在动物试验平台的电极支架上,仔细调整其角度(这些事情可以在更早的准备阶段先弄好),以下图所示的角度轻微地接触角膜的中心顶端。一通道正极接右眼,二通道正极接左眼。

 

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        通过针管对双眼滴生理盐水,改善金环电极及角膜的接触效果。


        请力求完美地保证两个金环电极以相同的角度,方式接触两眼角膜中心正端的相同位置。原因有二:

a.      角膜上不同位置的电位存在较大差异,通常认为顶端电位最高;不同的接触位置会带来眼别间不真实的结果振幅差,对同一只鼠不同次ERG测试的结果也会带来“差异”。

b.      金环电极会遮挡一部分刺激光线,相同的角度及位置可以避免眼间差异。

 

理想的角度如下图所示:

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        请脑补:金环(羽毛球拍)从斜后方来,侧面贴在角膜(足球)的顶端最高处。

 

        必要时,另一操作者在计算机边观察红外实时图像,可以协助帘后的操作者安装电极。从闪光刺激器内置的红色监视摄像头获取的图像上看,固定并安装好电极的小鼠大概是下图的模样:


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电极安装质量的确认


  将小鼠随动物试验台一起推入闪光刺激球,动物的眼睛应充分暴露于闪光刺激球内。

在计算机方面新建“病人”,录入小鼠的编号,并在描述中注明动物的周龄,所做的建模处理或者治疗等情况。然后进入FERG-暗适应0.01程序,示波,如果电极安装良好,示波时的波形如下:


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        理想的示波信号:  轻微振荡,接近直线的两条曲线


        如果电极没有接好,示波信号会表现为大幅的正弦波,或杂乱无章的巨大波动;当动物麻醉深度不够时,其呼吸可能导致示波信号的中轻度波动(角膜电极的周期性接触-离开),如下图:


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        此外,有时也会在示波信号中看到短暂的规律出现的干扰小波(如上图所示),这种干扰有时还很大,这是因心跳引发的ECG信号:通常将针电极(负)向远离心脏侧作些调整,即可消除。不要试图将针电极(负)扎入尾巴,这样将导致更大的ECG干扰(正负电极便处于心脏的两端)。

那么,将金环电极含在小鼠的嘴作负极怎么样?  笔者认为是个好主意,因为,这样,正负电极都位于心脏的同一侧,且距离很远,可以有效的避免ECG的干扰。

 

记录


        示波信号确认无误后,关闭暗红光。

        可以先尝试记录一下暗适应0.01 ERG,确认一下信号的质量:


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        如果双眼的振幅出现了与预期不同的较大差异,建议再次检查金环电极的安装位置。


        由于刚才的暗红光照明对暗适应有所破坏,杆系统兴奋程度受到影响。所以此时的信号振幅是较低的,在暗适应0.01的波形里还可以看到锥细胞的a波。应补充暗适应15分钟。打开定时器,等…

 

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        时间到后,再次记录暗适应0.01, 示波,观察示波信号无问题后“开始记录”。电生理系统会闪光3次(取决于系统设置),叠加,并得到波形。一般地,可以观察到,由于补充暗适应的原因,振幅会有显著增加。每项检查应至少重复一次,将两次的波形叠加,以确认记录的可靠性。


        然后依次记录暗适应3.0,  暗适应3.0振荡电位以及明适应3.0。需要注意的是,进入明适应3.0后,系统将自动打开背景光。同样地,需要打开定时器,明适应10-15分钟,再记录。



剔伪


        如果麻醉深度不够,动物苏醒,你可能得到这样的记录波形:


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        这个波形中可以看到明显的基线漂移:在理想的记录里,竖线(闪光开始)前应接近水平。

        同时,这个波形里也可以看到因为呼吸导致金环与角膜短暂离断导致的伪迹。

        伪迹和漂移的基线都有可能导致结果曲线失真。由于结果曲线是由3-5次闪光刺激的曲线叠加平均得来的,所以我们可以人工审视每次闪光的曲线,把“不好”的去掉。大多数电生理设备都提供“剔伪”或“离线分析”的功能,我们用的设备是下图这个样子:


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        通过“箭头”可以浏览每次闪光所导致的曲线,比如现在显示的这条:黄色的竖线表明这里发生了闪光,旁边的文字3@00:11:011说明这是第3次闪光,发生在检查开始后第11秒11毫秒;可以看到,黄竖线前的曲线不接近水平,提示了基线漂移;在闪光之后的100多毫秒后,出现了来源不明的尖峰“伪迹”;些时,点“Reject”, 软件便会在结果曲线叠加平均时忽略这次闪光的结果,“不好”的信号被成功忽略,下图是剔伪之后的结果曲线:

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典型的波形


  结果波形受小鼠的品种、年龄、角膜电极的种类、明暗适应时间、刺激参数(强度,间隔)等多种因素的影响。在我们所使用C57小鼠(右眼,NMDA 24h, 左眼正常)上,得到了下述波形:

 

暗适应0.01   (0.01 cd*s/m2)                

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4L(左眼)为正常曲线:通常具有一个接近水平的a波,以及振幅在500-1000uV的b波;此时的b波,反应与视杆相连的双极细胞功能。在b波上,应能看到明显的3个振荡电位(OP)子波。                

5R(右眼)因为青光眼造模,观察到明显的b波振幅下降。                

                 

暗适应3.0   (3.0 cd*s/m2)                

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8L(左眼)为正常曲线:通常具有400-800uV的a波,1000-2000uV的b波。在a,b波上,应有5个左右的振荡电位(OP)子波。此时的a波是由锥杆感受器共同产生的,而b波来源于锥和杆的双极细胞。由于OP是同时由锥杆系统驱动的,所以这里的OP子波数量多于暗适应0.0.1(仅由杆系统驱动)。                

5R(右眼)由于青光眼造模导致的双极细胞受损,b波振幅严重下降。但其a波保持了与左眼类似的形状和幅度,提示感受器工作仍然较好。                

                 

暗适应3.0 振荡电位  (3.0 cd*s/m2)                

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    振荡电位是ERG中的高频成分,原始ERG信号去掉低频部分后,a,b波被去除,只剩下5-7个OP子波,其中3个较大。2L(左眼)为正常曲线,三个子波的振幅相加大约1000-2000uV。1R(右眼)由于造模引发的双极细胞损害,振幅明显下降。需要注意的是,OP的振幅下降是间接引发的,OP的来源一般认为是内丛状层-无长突细胞,它本身受到双极细胞的驱动。来自双极细胞的信号变小之后,OP便跟着变小了。                

                 

明适应3.0 (30cd/m2背景照明,3.0 cd*s/m2闪光)                

               

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    作为在黑暗环境生活的动物,小鼠的锥细胞较少,明适应的ERG振幅b波仅有不到200uV。笔者作了一下简单的试验,不同的背景照明和不同的闪光刺激强度,得到的明适应ERG的波形形状(OP子波以及潜伏期)会有明显差异。                

    如果您的实验设计需要单独研究视锥系统的功能,明适应ERG则有一定参考价值。                

                 

 

白内障和死亡

        一般认为,小鼠白内障的形成与两个因素有关:

a.       金环电极构成的压迫

      温柔一点! 金环电极仅需要从侧面轻微接触角膜中心顶端,不要太大压力!

b.      暗适应下的强闪光刺激

      每项检查少重复几次,也就是少闪几次光。

 

        动物的死亡显然跟麻醉有关,使用呼吸麻醉有助于降低死亡率;通过复苏毯保持恒温也有助于避免死亡。需要注意的是,复苏毯有可能对电生理信号构成干扰。建议将复苏毯的开关或者插头安置在帘外计算机一侧,如果干扰存在,可在记录时临时关闭,暗适应及其它操作环节开启复苏毯。

 

VEP记录


        ERG记录可以帮助我们评估网膜功能。如果想评价视神经以及之后的整个视路,则只能借助于VEP。下图是我们在SD大鼠上记录到的闪光VEP:

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  相较于ERG记录,VEP记录的难度更高。上述三条曲线是同一只鼠记录三次的结果,可以看到,信号是重复可信的。如果读者们感兴趣,下次我们再讨论大鼠的VEP记录。

 

2018年9月24日 12:18
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